菌种概述与相关介绍

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菌种，作为发酵过程中的活细胞催化剂，涵盖了细菌、放线菌、酵母菌和霉菌这四大类微生物。这些菌种源自大自然的广泛微生物群，经过精心的分离、筛选和改良后，被妥善贮存以备生产之需。在微生物学及生命科学研究中，菌种扮演着至关重要的角色，不仅是食用菌、工业菌、农用菌等菌丝体及其生长基质的繁殖材料，更是医学领域中诊断制品制备、菌苗生产、微生物致病性研究以及药物抑菌试验和药品微生物检验等不可或缺的基础材料。菌种通常被划分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三个层级。

法律法规对菌种的管理有着明确的规定。
2006年3月，中华人民共和国农业部颁布了《食用菌菌种管理办法》，其中明确规定了农业部对全国菌种工作的主管责任，同时要求县级以上地方人民政府农业行政主管部门负责本行政区域内的菌种管理工作。该办法还强调了加强食用菌种质资源保护和良种选育、生产、更新、推广工作的重要性，并鼓励选育、生产、经营相结合的模式。

在菌种筛选方面，该办法提到了筛选分离的重要步骤，包括菌种分离、初筛和复筛，旨在挑选出具有特定能力的有用菌种。此外，还详细介绍了从土壤或腐生植物中收集含菌样品，并通过无菌水稀释、涂布于适宜的培养基上培养一定时间，以获得各种纯种菌株的过程。

针对不同的筛选目的，该办法也提出了相应的筛选模型。例如，筛选抗生素产生菌时，可以采用将纯种移至含有试验菌的琼脂培养基上进行培养，观察是否有透明的抑菌圈出现，以判断菌种是否具有产生抗菌物质的能力。经过摇瓶液体发酵和抗生素含量测定后，可以选出生产能力高的菌种作为生产菌种。

同时，该办法还强调了对所提取的抗生素进行结构分析、药理试验及临床试验等必要步骤，以确保所筛选出的抗生素确实有效。此外，还介绍了筛选脂肪酶生产菌种的方法，通过恒温培养和摇瓶发酵测定酶活力，挑选出产量高者作为生产菌种的出发菌株。

在改良制备方面，该办法并未具体涉及，但可以理解为通过不断优化筛选模型、改良制备工艺等方式，进一步提高菌种的质量和产量。
在菌种改良方面，可以采用遗传育种的方法，通过突变和重组技术，对野生型菌株进行改良，以获得产量高、成品质量好或具备新特性的优良菌种。具体来说，就是利用诱变育种、杂交育种、细胞融合技术和重组DNA技术等手段，对生产菌株进行遗传改良。其中，诱变育种是一种常用的方法，通过物理或化学诱变剂处理生产菌株，以获得高产突变株。随后，经过突变株的筛选，选出具有优良性状的高产菌株。虽然随机突变群体中有益突变的比例较低，但通过大量筛选，仍然可以获得高产突变株。此外，还可以通过理性筛选法，根据生物合成途径中的反应点进行选育，以提高产率或其他特性。

种子制备是菌种改良过程中的一个重要环节。它是指在一定条件下，通过扩大培养使菌种数量和质量达到一定标准，从而为后续的发酵工艺提供足够的纯生产菌种。种子制备包括孢子制备和菌丝体制备两个步骤，以确保接入发酵罐中的菌体量和合成产物的质量。

菌种制备

菌种制备是种子制备的基础，其关键步骤包括孢子制备。首先，从沙土管或冷冻管中取出少量生产菌种，然后将其接种到琼脂斜面培养基上，在适宜的温度下进行培养。经过一段时间的培养后，可以获得大量孢子。为了进一步增加孢子的数量，可以使用具有较大表面积的固体培养基进行培养。对于霉菌类孢子，常采用大米、小米等天然培养基。

在孢子成熟后，需要将其制成悬浮液，并接种到扁瓶固体培养基上，继续进行培养。培养完成后，将成熟的孢子进行真空干燥，降低水分含量至10%以下，然后存放在4℃的冰箱中备用。通常，一次制备的孢子瓶可以在生产上使用半年左右。

此外，对于不产孢子或产孢子较少的生产菌种，可以采用摇瓶液体培养的方法获得菌丝体作为种子。种子罐的作用是使有限的孢子或菌丝体能够迅速发芽、生长和繁殖成大量菌体。在种子罐中，需要提供易于被菌体利用的碳源、氮源和无机盐等营养物质。

保存方法

为了保持优良菌种的稳定性，需要采取适当的保存方法。其中，一种常用的方法是选取优良菌种的休眠体（如孢子或芽孢）或富有生命力的悬浮液，在低温或脱水状态下进行保存。这样可以确保菌种的性状在保存过程中保持稳定，为后续的生产提供可靠的保障。
简单保存法：将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱内保存，保存时间通常不超过1～2个月。若采用真空包装并浸蜡棉塞，以隔绝空气和水汽，则保存时间可延长至3～4个月。

液氮超低温保存法：将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内。通过控制冷却速度，使安瓿管逐渐降至-35℃，随后置于-150～-196℃的液氮罐中保存。此方法适用于大多数微生物，如病毒、噬菌体、细菌、放线菌、酵母和原虫，尤其适用于冷冻干燥法难以保存的微生物。

脱水保存法：

① 沙土保存法：适用于能产孢子的细菌、放线菌及霉菌。将沙和土以3:2的比例混合，经过稀酸处理、洗净过筛后装入小试管内。将生长良好的孢子制成孢子悬液，吸取少许加入沙土管中，经真空抽干后，于4℃冰箱保存，保存期可达5～7年。

② 冷冻干燥法：将孢子悬浮液与保护剂（如脱脂牛奶或血清）混合，放入安瓿管中在-20～-30℃的乙醇浴中迅速冷冻。随后在低温下用真空泵抽干，并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻，最后熔封安瓿管并低温保存。此方法的保存期可达5～10年。

③ 石蜡油封存法：在斜面菌种培养物上倒入灭菌后的石蜡油，高度超出斜面1cm，然后置于4℃冰箱或低温干燥处保存。但请注意，此方法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物，保存期为一年以上。

此外，在食用菌的生产中，菌种通常指的是经过人工培养的纯菌丝体连同培养基质。根据菌种的来源、繁殖代数及生产目的，菌种在生产中可分为母种、原种和栽培种，分别对应一级种、二级种和三级种。
母种是通过将纯菌丝体或孢子在试管培养基中繁殖而成的。它不仅适宜于菌种保藏，还可以进一步繁殖原种。原种则是在母种菌丝的基础上，通过在固体培养基上的进一步繁殖来形成的。这一过程不仅增强了菌丝对培养环境的适应性，还起到了扩繁的作用，并且可以直接用于出菇。而栽培种则是由原种进一步扩繁而成，主要目的是为生产提供足够的菌种。

为了获得某种真菌类药材的纯菌种，我们需要将其从其他微生物中分离出来，这就是菌种的分离过程。常用的分离方法包括组织分离法和孢子分离法。

组织分离法需要先选取新鲜、壮实且无病虫害的子实体或菌核作为分离材料。经过表面消毒和无菌处理后，将其放入PDA培养基中培养。当周围长出白色菌丝时，再移至斜面试管培养基中继续培养，即可得到纯菌种。

孢子分离法则包括褶上涂抹法和孢子印采集法。在褶上涂抹法中，我们首先对子实体进行表面灭菌处理，然后在无菌条件下将接种环在菌褶上涂抹，将带孢子的接种环在培养基上划线接种，最后进行恒温培养即可得到纯菌种。而孢子印采集法则更简单直接，只需将灭过菌的载玻片或黑布置于新鲜子实体的下方，等待孢子落下形成印痕后，用接种环或玻璃棒蘸取孢子进行接种和培养即可。
(3) 孢子收集器采集法：该法需准备玻璃钟罩、培养皿、三角架和搪瓷盘等器材。钟罩下方置一搪瓷盘，盘内垫衬4～6层纱布，中央放一9厘米直径的培养皿，大盖口朝下，上放小培养皿，口向上。接着，将铅丝绕成的三角架置于小培养皿上，再盖上带孔的玻璃钟罩，顶孔用棉塞塞紧。最后，将整个孢子收集器用纱布包好，置入高压灭菌锅或蒸笼内灭菌2小时。

灭菌后的孢子收集器放入无菌室或无菌箱内。用小刀割取一块4～5厘米大小的子实体，插在收集器内的三角架顶上。然后置于24～26℃下培养24小时，培养皿中便可见到白色粉状物，即孢子。此时，将孢子收集器移至接种箱内，取出培养皿并盖好。向培养皿内加入10～20毫升的无菌水，使孢子悬浮于水中，成为孢子悬浮液。再用无菌打针筒或吸管吸取孢子悬浮液，接种于试管斜面培养基上，每管注2～3滴。置于24～26℃下培养5～7天，培养基上便可长出白色菌落。待菌落直径达0.5厘米时，选健壮菌落再移接至另一试管的斜面培养基上培养。当白色菌丝长满试管时，便得到纯菌种。

此外，还有寄主分离法，即从生长有某种真菌的寄主体上取下木片进行分离。如木耳制种时，可选野生、朵大、出耳多、质厚的耳棒。采集后，削去耳根下的树皮，将其横断面锯成1厘米厚的木片。在无菌条件下，切去无耳菌丝部分，留下有耳菌丝部分，浸入0.1%升汞水中1分钟，取出后用无菌水冲洗干净。接着，用解剖刀将木片切成0.5厘米的小块，放入斜面培养基内培养。在此过程中需及时淘汰杂菌，选取纯菌丝进行移植培养，即可得到所需的菌种。